Implementer raskt strømningscytometerkonstruksjoner ved å bruke datainnsamlingsmoduler med høy nøyaktighet

Strømningscytometri brukes ofte av klinikere og diagnostikere for å analysere celleegenskaper. En celle av gangen, evaluerer de optisk både proteinnivåer, blodhelse, granularitet og cellestørrelse, samt andre egenskaper. Selv om de er svært følsomme systemer, er konstruktører av cytometre under konstant press til å akselerere analysetiden, noe som krever nye tilnærminger til både strømningscytometri og tilknyttet elektronikk.

Cytometre utsetter individuelle celler for laserlys for å skape spredte signaler og fluorescerende signaler. For å raskt og nøyaktig fange det resulterende lyset og konvertere det til digitale signaler, kreves en skredfotodiode (APD – avalanche photodiode) og kompleks elektronikk. Strømkretsene for denne prosessen kan ta lang tid å konstruere og implementere, spesielt gitt at datainnsamlingssystemer for strømningscytometri krever raske enheter med lav støy for å sikre systemnøyaktighet.

For å støtte raskere strømningscytometrianalyse på en kostnadseffektiv måte, kan konstruktører løse problemer relatert til hastighet og nøyaktighet med en datainnsamlingsløsning som omfatter interne forsterkerdrivere og en A-D-omformer (ADC).

Denne artikkelen vil kort vise hvordan systemer for strømningscytometri fungerer. Den introduserer deretter Analog Devices sin ADAQ23878, en 18-biters ADC-modul, og den viser hvordan denne kan brukes til å konstruere et deteksjons- og konverteringstrinn for strømningscytometre. Et tilknyttet evalueringssett introduseres også.

Prinsipper for moderne strømningscytometri

Moderne strømningscytometri er en automatisert prosess som analyserer celle- og overflatemolekyler, og karakteriserer og definerer forskjellige celletyper i en heterogen cellepopulasjon. Hvis vi ser bort fra forberedelsestiden, som kan være mer enn en time, utfører instrumentet en vurderinger av tre til seks egenskaper for 10 000 enkeltceller på mindre enn et minutt.

For å aktivere dette, er strømningscytometerets forberedelsestrinn for enkeltceller avgjørende. Organiseringen av prøvene skjer hydrodynamisk i en hylsevæske (sheath fluid) for å fokusere celler eller partikler inn i en smal, encellet linjeprøvestrøm (line sample stream) for analyse. Med denne transformeringen må enkeltcellene opprettholde sine naturlige biologiske egenskaper og biokjemiske bestanddeler.

Figur 1 viser et skjema over et strømningscytometerinstrument som starter øverst med den flercellede prøven.

Figur 1: Skjema over et strømningscytometer, fra hylsefokus til datainnsamling. (Bildekilde: Wikipedia, modifisert av Bonnie Baker)

De seks hovedkomponentene i strømningscytometeret er en strømningscelle, en laser, en skredfotodiode (APD), en transimpedansforsterker (TIA), en A-D-omformer (ADC) og en datamaskin for datainnsamling og analyse.

Strømningscytometeret har en væskestrøm eller hylsevæske, som er innsnevret for å bære og justere cellene til en enkel fil gjennom lysstrålen. Laserlyset fanger én celle av gangen, og skaper et signal med foroverspredt lys (FSC – forward-scattered light) og et sidespredt lys (SSC – side-scattered light). Fluorescerende lys sorteres ved hjelp av speil og filtre, og forsterkes deretter av en APD.

Neste trinn er å detektere, digitalisere og analysere den resulterende lysproduksjonen etter at lyset treffer APD-en. For deteksjon er Analog Devices sin LTC6268-operasjonsforsterker, som har ultralav forspenningsstrøm på 500 megahertz (MHz) og FET-inngang med lavspent støy, ideell for de høyhastighets TIA-ene som trengs for deteksjon.

Figur 2: TIA-kretsen bruker en APD (PD₁) og en FET-operasjonsforsterker med lav inngangsstrøm for å omforme ultralave fotodiodestrømmer til en utgangsspenning på IN1+. (Bildekilde: Bonnie Baker)

Det er viktig å konstruere denne forsterkerkretsen med størst mulig båndbredde, så parasittiske kapasitanser er nødt til å minimeres. Den parasittiske tilbakekoblingskapasitansen, C, påvirker for eksempel figur 2 sin kretsstabilitet og båndbredde. Uavhengig av valget av motstandskapsling, vil det alltid være en parasittisk kapasitans i forsterkerens tilbakekoblingsbane. En 0805-kapsling, som har en lengre avstand mellom endehettene og den laveste parasittiske kapasitansen, er imidlertid å foretrekke for høyhastighetskonstruksjoner.

Økning av avstanden mellom endehettene til R₁ er ikke den eneste måten å redusere kapasitansen på. En annen måte å redusere kapasitans fra plate-til-plate, er å skjerme E-feltbanene som gir opphav til den parasittiske kapasitansen ved å plassere en ekstra jordingsbane under motstanden, R₁ (figur 3).

Figur 3: Ved å legge til en jordingsbane under feedbackmotstanden, kobles E-feltet bort fra tilbakekoblingssiden og dumpes til jord. (Bildekilde: Analog Devices)

I dette tilfellet innebærer måten å plassere en kort jordingsbane under og mellom motstandsplatene nær TIA-ens utgangsende. Denne teknikken gir en parasittisk kapasitansverdi på 0,028 pikofarad (pF) med en TIA-båndbredde på 1/(2π*R_F*C_PARASITIC), som tilsvarer 11,4 MHz.

De optiske lyssignalene peker mot flere skreddioder med egnede optiske filtre. APD-, TIA- og ADC-systemet konverterer disse signalene til sin digitale representasjon og sender dataene til mikroprosessoren for videre analyse.

Moderne instrumenter har vanligvis flere lasere og APD-er. Dagens kommersielle enheter har ti lasere og tretti skredfotodioder. Ved å øke detektortallet til laseren og fotomultiplikatoren, muliggjøres flere antistoff-påskrifter (anti-body labeling) for å identifisere målpopulasjoner nøyaktig ved hjelp av fenotypiske markører.

Analysens hastighet avhenger likevel av en fin balanse av:

• Hastigheten til væskehylsen (fluid sheath)
• Den hydrodynamiske fokusprosessens evne til å danne encellede linjer
• Tunnelens diameter
• Evnen til å bevare integriteten til en celle
• Elektronikken

Akustisk fokusering for strømningscytometri

Selv om det å legge til flere lasere og APD-er akselererer analyse og identifikasjon, kan de nyeste moderne enkeltcellede strømningscytometrimåtene i beste fall samle inn data om opptil én million individuelle celler per minutt. For mange bruksområder, for eksempel deteksjon av sirkulerende tumorceller i blodet ved nivåer så lave som 100 celler per milliliter, er dette utilstrekkelig. I kliniske bruksområder med sjeldne celler, krever tester regelmessig en tidkrevende analyse av milliarder av celler.

Alternativet til den hydrodynamisk fokuserte celleforberedelsesprosessen, er en akustisk fokuseringsprosess. Her er et piezoelektrisk materiale, for eksempel blyzirkonattitanat (PZT), festet til en glasskapillar for å konvertere elektriske pulser til mekaniske vibrasjoner (figur 4a). Ved å bruke en PZT til å vibrere sideveggene i en glasskapillar ved den rektangulære strømningscellens resonansfrekvens, genererer systemet en rekke akustiske stående bølger med et varierende antall trykknoder.

Figur 4: Illustrasjon av en akustisk strømningscelle laget med en rektangulær glasskapillar (a). Plasseringen av de første tre trykknodene for en kapillar med fast bredde (b). (Bildekilde: National Center for Biotechnology Information)

Disse PZT-frekvensnodene justerer strømmende partikler i flere diskrete strømlinjer (figur 4b). Den akustiske strømningscellen bruker en lineær, stående akustisk bølge til å justere inn forskjellige bølgelengder ved å produsere enkle eller flertallige harmoniske oversvingninger. Som forutsagt av den enkle, lineære stående bølge-modellen, produserer cellene i prøven enkle eller flertallige enkeltcellelinjer inne i strømningskammeret.

Med denne nøyaktige organiseringen av celler, kan bredden på strømningshylsetunnelen utvides slik at raskere strømningshastigheter forbi laserstrålen er mulig (figur 5).

Figur 5: Med den hydrodynamiske prøvestrømmen (c. og d.), mens hylsebredden økes, spres celleprøvene, noe som gjør den optiske måleprosessen vanskelig. Akustisk fokuserte prøvestrømmer (a. og b.) opprettholder enkeltfil-celler, uavhengig av hylsebredden. (Bildekilde: Thermo Fischer Scientific)

Tradisjonell hydrodynamisk fokusering (figur 5c.) arrangerer enkeltcellelinjene for å forberede til laserskanning. Mens en bredere trakt for prøvestrømmens kjerne muliggjør en høyere hylsematerialhastighet (figur 5d), resulterer den også i spredning av encellet organisasjon, noe som produserer signalvariasjon og kompromittert datakvalitet.

Akustisk fokusering (figur 5a.) plasserer biologiske celler og andre partikler tett justert, selv med en bredere tunnel. Denne nøyaktige cellejusteringen tillater høyere prøvehastigheter, samtidig som datakvaliteten opprettholdes (figur 5b).

I praksis vil akustisk fokusering for strømningscytometri øke celleprøvefrekvensen med ~20x (figur 6).

Figur 6: Sammenligning av prøvetid for variert utstyr for strømningscytometri basert på væskestrømningscytometri (A, B, C) kontra akustisk fokuscytometri (D). (Bildekilde: Thermo Fischer Scientific)

I figur 6 bruker utstyr fra A, B og C hydrodynamisk teknologi, mens D bruker akustisk fokusering for cytometristrømning.

Datainnsamling for akustisk fokusering for strømningscytometri

Konstruksjonen av elektronikken for akustisk fokuserende strømningscytometriutstyr, krever fotofølsom elektronikk med høy hastighet for å imøtekomme hastigheten til blodcellene og hylsevæsken gjennom dysen med større diameter. Den 600 MHz LTC6268-enheten med høy hastighet som ble nevnt tidligere, i kombinasjon med en spesialisert 0805-motstandskapslingslayout, bringer den optiske sensorfrekvensen opp til 11,4 MHz (figur 7, venstre). Utgangen på LTC6268 mates til en Analog Devices ADAQ23878 ADC for digitalisering.

Figur 7: ADAQ23878 ADC-en digitaliserer det optiske signalet fra fotodioden (PD₁) og TIA-kretsen (venstre). (Bildekilde: Bonnie Baker)

ADAQ23878 er en nøyaktig, høyhastighets system-in-package (SIP)-datainnsamlingsløsning med 18 bits og 15 megasamplinger per sekund (MSPS). Den reduserer utviklingssyklusen til presisjonsmålesystemer kraftig ved å overføre konstruksjonsbyrden relatert til inngangsdriverens komponentvalg, optimalisering og layout fra konstruktøren til enheten.

SIP-ens modulære tilnærming reduserer sluttsystemets komponentantall ved å kombinere flere vanlige signalbehandlings- og kondisjoneringsblokker i én enkelt enhet, sammen med A-D-omformeren (ADC) for det høyhastighets suksessive approksimasjonsregisteret (SAR) med 18-bits og 15 MSPS. Disse blokkene omfatter en støysvak, fullstendig differensiell ADC-driverforsterker og en stabil referansebuffer.

ADAQ23878 innlemmer også de viktige passive komponentene som bruker Analog Devices sin iPassive-teknologi til å minimere temperaturavhengige feilkilder og optimalisere ytelsen. ADC-ens hurtig-innstillende driverstadie bidrar til å sikre rask datainnsamling.

Evaluering av ADAQ23878 µModule

For å evaluere ADAQ23878 har Analog Devices evalueringskortet EVAL-ADAQ23878FMCZ (figur 8). Kortet demonstrerer ytelsen til ADAQ23878 μModule, og det er et allsidig verktøy når det gjelder å evaluere en frontend-konstruksjon for strømningscytometri, samt en rekke andre bruksområder.

Figur 8: EVAL-ADAQ23878FMCZ-evalueringskortet for ADAQ23878 har strømkretser på kortet, det leveres med tilknyttet programvare for styring og dataanalyse, og det er SDP-H1-kompatibelt. (Bildekilde: Analog Devices)

EVAL-ADAQ23878FMCZ-evalueringskortet krever en datamaskin som kjører Windows 10 eller nyere, en signalkilde med lav støy og presisjon og et båndpassfilter som er egnet for 18-bits testing. Evalueringskortet trenger ADAQ23878 ACE-tillegget og SPD-H1-driveren.

Konklusjon

Undersøkelsen av én biologisk celle av gangen ved å bruke standard hydrodynamisk fokusstrømningscytometri har vært vellykket, men siden det er et behov for raskere analyse, har det vært en overgang til teknikker basert på akustiske fokusstrømningsmetoder. Elektronikken som støtter mer avansert strømningscytometri må også forbedres, samtidig som plass, kostnader og utviklingstid minimeres.

Som vist kan LTC6268-operasjonsforsterkeren med høy hastighet og ADAQ233878 μModul-datainnsamlingsløsningen med presisjon og høy hastighet kombineres for å skape et komplett datainnsamlingssystem for avansert strømningscytometriutstyr.